理化学研究所（理研）環境資源科学研究センター ホロビオント・レジリエンス研究チームの矢部 修平 研究員、市橋 泰範 チームディレクターらの国際共同研究グループは、土壌に広く分布する菌糸形成細菌クテドノバクテリア^[1]が、医農薬の候補物質を生み出し得る多様な二次代謝物^[2]生合成遺伝子群（BGC）^[3]を持ち、それらが巨大な染色体外DNA^[4]（クロミド様DNA^[5]）に集中していることを明らかにしました。

本成果は、クテドノバクテリアが、これまで主流だった放線菌^[6]を補完する新たな二次代謝物探索のフロンティアとなり得ることを示し、今後、クロミド様DNAに蓄積された遺伝子群の働きを解明することで、未知の有用化合物や医農薬候補物質の探索が進むことが期待されます。

今回、国際共同研究グループは、クテドノバクテリアの主要な生息環境の一つであり、未開拓な土壌細菌が生息する火山地帯に着目し、火山荒廃土壌が広がる蔵王火山の土壌から新たに分離した菌株のゲノム（全遺伝情報）を解読し、同じ土壌から得られたメタゲノム情報および公共データベースのゲノム情報と統合して、計183のクテドノバクテリアゲノムを比較解析しました。その結果、全体の約4分の1に当たるゲノムが多様なBGCを持つこと、また検出されたBGCの多くが既存データベースに登録されたものとは系統的に大きく異なることを明らかにしました。さらに、これらのBGCがクロミド様DNAに集中的に存在することが分かりました。一方で、このような大型の染色体外DNAは従来のメタゲノム解析^[7]では見落とされたり、正しく回収されにくかったりした可能性も示唆され、培養株に基づくゲノム解析の重要性が改めて示されました。

本研究は、科学雑誌『mSystems』オンライン版（5月29日付：日本時間5月29日）に掲載されました。

背景

バクテリアが生産する二次代謝物は高い化学的多様性を持ち、抗生物質をはじめとする医薬品の主要な供給源として長年利用されてきました。しかし、これまでの探索は、ストレプトマイセス属^[8]に代表される放線菌など、限られた培養可能な微生物系統に大きく依存してきました。そのため、先人による長年にわたる探索により、従来の対象から新規化合物を見いだすことは次第に難しくなっています。多剤耐性菌の拡大が深刻な課題となる現在、新たな二次代謝物を生み出す生物資源を開拓することが強く求められています。

クテドノバクテリア（綱）は、砂漠や極地、火山荒廃土壌から農地まで幅広い環境に分布する土壌細菌であり、分岐菌糸形成という放線菌様の形態的特徴を持つことから、放線菌に代わる新たな資源として注目されています。一部の培養株からは実際に新規化合物が見つかっており、本分類群が多様な二次代謝生産能力を持つ可能性が示唆されています。一方で、クテドノバクテリアは培養が難しく、またゲノムが大きいことからメタゲノム解析による回収も容易ではありません。そのため、ゲノム構造や代謝ポテンシャルの全体像は十分に明らかになっておらず、資源としての評価は遅れていました。

近年、メタゲノム解析の進展によりバクテリア関連ゲノム情報は増加しつつありますが、依然として断片的であり、培養株とメタゲノム由来ゲノム^[9]を統合した包括的な解析が求められています。そこで本研究では、蔵王火山から新たに分離した菌株ゲノムとメタゲノム由来ゲノム、および公開データを統合し、クテドノバクテリアの二次代謝生産能力に着目した比較ゲノム解析^[10]を行いました。

研究手法と成果

国際共同研究グループは、蔵王山の火山湖「御釜（おかま）」（宮城県）周辺に広がる火山荒廃土壌を対象に、クテドノバクテリアの分布、分離培養、メタゲノム、二次代謝生産能力を総合的に解析しました。まず、植生の乏しい土壌から比較的植物に覆われた土壌までを含む複数地点から表層土壌を採取し、微生物群集解析を行いました。その結果、クテドノバクテリアは同地域の土壌における主要な細菌群の一つであり、特に植物被覆の少ない火山荒廃土壌で高い割合を示す傾向を確認しました。

次に、同じ土壌を用いてクテドノバクテリアの分離培養を試みました。クテドノバクテリアは一般に増殖が遅く、通常の培養条件では増殖の速い細菌に覆われやすいため、低栄養条件の培地を用い、水素イオン指数（pH）や抗菌物質を調整することで、他の細菌の増殖を抑えながら菌糸状のコロニーを選抜しました。その結果、蔵王火山土壌から二つの新しい系統のクテドノバクテリア培養株を取得することに成功しました（理研微生物材料開発室に寄託、Z7_2株JCM37047、Z4_9株JCM37048）。これらの培養株について系統解析した結果、1株（Z4_9株）は科レベルで新規の可能性が高い系統に位置することが分かりました。これらの培養株から長鎖DNAシーケンス^[11]を用いて高品質なゲノム配列を取得し、以後の比較解析の基盤としました。

さらに、国際共同研究グループは、今回取得した培養株のゲノムに加え、蔵王火山土壌から直接得られたメタゲノム由来ゲノム、および公共データベースに登録されているクテドノバクテリアゲノム情報を統合しました。これにより、培養株だけに偏らず、未培養系統を含む計183ゲノムを対象として、クテドノバクテリア全体の系統的位置、二次代謝物生合成遺伝子群（BGC）の多様性、そしてBGCが配置されるゲノム領域を比較することが可能になりました。

BGCの網羅的な予測と分類を行った結果、183ゲノムから合計1,546個のBGCが検出され、これらは1,162種類の非重複な遺伝子群ファミリー^[12]に分類されました（図1）。全体の約4分の1に当たるゲノムが10種類以上の異なる遺伝子群ファミリーを保持しており、複数の系統でBGCに富む特徴が見られました。特に一部の系統では、二次代謝物探索の代表的な対象であるストレプトマイセス属に近い水準のBGC多様性が認められました。

検出されたBGCの多くは、既存のBGCデータベースに登録されている既知の遺伝子群ファミリーとは大きく異なっていました。複数のデータベースを用いた比較では、クテドノバクテリア由来BGCの多くが既知BGCから離れた位置に分類されたことからも、既存の微生物資源では十分に捉えられていない二次代謝生産能力を持つ可能性が示されました。一方で、これらはゲノム情報に基づく予測であり、実際にどのような化合物がつくられるのか、またそれらがどのような生物活性や生態機能を持つのかについては、今後の培養実験や化学分析による検証が必要です。

次に、BGCがゲノム上のどこに存在するかを調べました。高品質なゲノム配列が得られた培養株を解析したところ、通常の染色体とは別に、1.6～3.5メガベース（Mb、1Mbは100万ベース、ベースは塩基の単位））もの巨大なDNAが複数の系統で見つかりました（図2）。これらの巨大DNAは小さな細菌のゲノムサイズにも匹敵するサイズで、一般的なプラスミド（小さな環状のDNA）とは異なり、GC含量^[13]やコドン使用頻度^[14]が宿主染色体と類似している特徴を持っていたことから、国際共同研究グループはこれらの巨大DNAを「クロミド様DNA」と位置付けました。一方で、クロミド様DNAで保持する遺伝子の内容は染色体とは大きく異なっていました。

さらに詳しく調べると、BGCは染色体上にも存在するものの、クロミド様DNA上に高密度に集積する（BGC占有率^[15]が高い）傾向が明らかになりました。加えて、クロミド様DNAには、二次代謝に関わる遺伝子だけでなく、DNAの移動や組換えに関わる遺伝子も多く含まれていました。組換え関連遺伝子はBGCの近傍、特に境界付近に集まりやすく、クロミド様DNAが二次代謝関連遺伝子を蓄積のみならず、環境への適応のために多様化させる場としても機能している可能性が示されました。

こうした結果は、クテドノバクテリアにおいて、二次代謝生産能力が単に個々の遺伝子群の有無だけでなく、巨大な染色体外DNAというゲノム構造と密接に関係していることを示しています。通常の染色体が細胞の基本的な生命活動を支える遺伝子を多く保持する一方で、クロミド様DNAは、二次代謝や環境適応に関わる遺伝子を蓄積する補助的なゲノム領域として働いている可能性があります。

最後に国際共同研究グループは、このような巨大な染色体外DNAが、従来のメタゲノム解析で正しく回収されるかを検証しました。培養株から得られた高品質なゲノム配列を基に、人工メタゲノムデータを生成し、一般的なゲノム再構築手法で染色体とクロミド様DNAを分離できるかを調べました。その結果、解析手法によってはクロミド様DNAが染色体と一体化して扱われたり、他のゲノム断片と混在した形で回収されたりすることが分かりました。クテドノバクテリアに限らず他のバクテリアにおいても、従来のメタゲノム解析だけでは、巨大な染色体外DNAとそこに集積するBGCや環境適応遺伝子が見落とされ、重要な機能遺伝子が過小評価されてきた可能性が示されました。

本研究では、クテドノバクテリアが既存データベースとは大きく異なる多様なBGCを広く保持すること、またそれらの多くをクロミド様DNAに集中するゲノム構造を有していることを明らかにしました。さらに、こうした構造はメタゲノム解析のみでは十分に捉えられない可能性があり、培養株に基づいた高品質ゲノム解析をメタゲノム解析と組み合わせる手法の重要性が示されました。本成果は、クテドノバクテリアが新たな二次代謝物探索の対象であることとともに、微生物の二次代謝生産能力を支えるゲノム構造を理解する上でも重要な分類群であることを示すものです。

今後の期待

本研究により、クテドノバクテリアが、これまで二次代謝物探索の中心であった放線菌を補完する、新たな微生物資源となる可能性が示されました。今後、今回の培養株をさらに検証し、見いだされた遺伝子群により実際にどのような化合物が生み出されるのかを調べることで、未知の有用化合物や医農薬候補物質の発見につながることが期待されます。

また、本研究では、二次代謝物の生産に関わる遺伝子群が、巨大な染色体外DNAであるクロミド様DNAに集中して存在することが明らかになりました。この特異なゲノム構造が、遺伝子群をどのように蓄積・多様化させてきたのかを解明することで、微生物が環境に適応しながら多様な化合物を生み出してきた仕組みへの理解が進むと考えられます。

さらに、従来のメタゲノム解析だけでは見落とされやすい微生物機能が存在することも示されました。培養株を用いた高品質なゲノム解析とメタゲノム解析を組み合わせ、未開拓の土壌微生物の能力を掘り起こすことで、医農薬開発に向けた新たな探索基盤の構築につながることが期待されます。

補足説明

• 1.クテドノバクテリア
  土壌などの陸域環境に広く分布する細菌の一群。菌糸状に成長するなど放線菌（[6]参照）に似た形態を示すが、系統的には放線菌とは異なる。本研究では、蔵王火山土壌から新たに分離した株を含め、計183ゲノムを対象に解析した。
• 2.二次代謝物
  微生物の増殖そのものに必須ではないが、生存競争、情報伝達、環境適応などに関わる化合物である。抗生物質、抗がん剤、農薬などの候補物質を含む。本研究では、クテドノバクテリアが多様な二次代謝物を生産する可能性に着目した。
• 3.生合成遺伝子群（BGC）
  二次代謝物をつくるために必要な複数の遺伝子が、ゲノム上でまとまって存在する領域。BGCの種類や数を調べることで、微生物がどのような化合物をつくり得るかを予測できる。本研究では、183ゲノムから1,546個のBGCを検出した。
• 4.染色体外DNA
  細菌のゲノム配列において、主要な染色体とは別に存在するDNA分子の総称であり、一般的なプラスミドから、クロミド様DNA（[5]参照）のような大型DNAまで含まれる。一般的なプラスミドは、染色体とは独立して維持され、薬剤耐性や環境応答など、特定の条件下で宿主に有利に働く遺伝子を持つことが多い。一方で、宿主の基本的な生命活動に深く関わる遺伝子を多く含むことは少なく、GC含量（[13]参照）やコドン使用頻度（[14]参照）などの配列特徴も宿主染色体とは異なることが多い。本研究で見つかった1.6～3.5Mbに達する大型の染色体外DNAには、BGCや環境適応に関わる遺伝子が多く含まれていた。
• 5.クロミド様DNA
  染色体外DNAのうち、GC含量やコドン使用頻度などの配列特徴が宿主染色体に近い大型の染色体外DNAである。小型のプラスミドとは異なり、宿主ゲノムに長期的に適応したDNAと考えられる。本研究では、BGCが高密度に集積する場として注目した。
• 6.放線菌
  菌糸状に成長する細菌を多く含む微生物群。抗生物質などの有用な二次代謝物を生産することで知られ、特にストレプトマイセス属（[8]参照）は医薬品探索の重要な対象とされてきた。本研究では、放線菌とは異なるクテドノバクテリアを新たな探索対象として位置付けた。
• 7.メタゲノム解析
  土壌などの環境試料からDNAを直接抽出し、そこに含まれる微生物全体のゲノム情報をまとめて解析する手法。培養が難しい微生物の情報を得られる一方、ゲノムが断片化されたり、染色体外DNAが正しく回収されにくかったりする場合がある。
• 8.ストレプトマイセス属
  放線菌に含まれる代表的な細菌の属。多くの抗生物質や生理活性物質を生産することから、微生物由来の医薬品探索でよく研究されてきた分類群である。本研究では、クテドノバクテリアのBGC多様性を評価する際の比較対象として用いた。
• 9.メタゲノム由来ゲノム
  メタゲノム解析で得られたDNA断片をつなぎ合わせ、特定の微生物に由来すると推定して再構築したゲノム。実際に培養した微生物のゲノムではないため、断片化や欠落を含む場合がある。本研究では、培養株ゲノムと組み合わせて解析した。
• 10.比較ゲノム解析
  複数の生物のゲノムを比較し、共通点や違いを調べる手法。遺伝子の数や種類、ゲノム構造、進化的な関係などを明らかにできる。本研究では、培養株、メタゲノム由来ゲノム、公共データベースのゲノムを統合して解析した。
• 11.長鎖DNAシーケンス
  長いDNA断片を読み取ることができるゲノム解析技術。短いDNA断片を読む従来法に比べて、複雑なゲノム構造や大きな染色体外DNAをつなげて解析しやすい。本研究では、培養株の高品質なゲノム配列を得るために用いた。
• 12.遺伝子群ファミリー
  配列や遺伝子構成が似ているBGCを一つのグループとしてまとめたもの。BGCの単純な数だけでなく、どれだけ多様な種類があるかを評価するために用いる。本研究では、検出された1,546個のBGCを1,162種類の遺伝子群ファミリーに分類した。
• 13.GC含量
  DNAを構成する4種類の塩基のうち、グアニン（G）とシトシン（C）が占める割合。生物種やゲノム領域によって特徴的な値を示すことがある。本研究では、クロミド様DNAが宿主染色体に近い配列特徴を持つかを調べる指標の一つとして用いた。
• 14.コドン使用頻度
  タンパク質を指定する3塩基の組み合わせであるコドンが、ゲノム中でどの程度使われるかを示す特徴。同じアミノ酸を指定する複数のコドンの使われ方には、生物種ごとに偏りがある。本研究では、クロミド様DNAが宿主染色体に近い傾向を持つかを調べるために用いた。
• 15.BGC占有率
  ゲノムまたは染色体外DNAのうち、BGCが占める割合。値が高いほど、そのDNA領域に二次代謝物の生産に関わる遺伝子群が高密度に存在することを示す。本研究では、Z7_2株のクロミド様DNAでBGC占有率が21.6％に達した。

国際共同研究グループ

理化学研究所 環境資源科学研究センター
ホロビオント・レジリエンス研究チーム
研究員 矢部 修平（ヤベ・シュウヘイ）
研究員 楊 重陽（ヤン・チョンヤン）
テクニカルスタッフⅡ 能勢 結衣（ノセ・ユイ）
研究員 山﨑 真一（ヤマザキ・シンイチ）
学振特別研究員PD 大熊 直生（オオクマ・ナオ）
チームディレクター 市橋 泰範（イチハシ・ヤスノリ）
天然物生合成研究ユニット
研究員 鄭 宇 （テイ・ウ）
ユニットリーダー 高橋 俊二（タカハシ・シュンジ）
質量分析・顕微鏡解析ユニット
技師 佐藤 繭子（サトウ・マユコ）
上級技師 豊岡 公徳（トヨオカ・キミノリ）

インドネシア大学 数学・自然科学学部 生物学科
講師 マジタ・キナンティ・ラフマニア（Mazytha Kinanti Rachmania）
講師 フィトリア・ニングシ（Fitria Ningsih）
教授 ウェリザル・シャムスリザル（Wellyzar Sjamsuridzal）

研究支援

本研究は、日本学術振興会（JSPS）科学研究費助成事業挑戦的研究（萌芽）「希少生物資源『天狗の麦飯』の保全に向けた繁殖・再生法の開発（研究代表者：矢部修平、JP25K22374）」、同基盤研究（B）「新門Vulcanimicrobiota（WPS-2）の培養化によって解き明かされる新しい光合成様式（研究代表者：矢部修平、JP25K01112）」、公益財団法人発酵研究所（IFO）一般研究助成研究課題1「微生物の分類に関する研究（分離、分類、保存）」の研究課題「候補門WPS-2の分離と系統分類及びリソースの拡充（研究代表者：矢部修平、G-2024-1-019）」、科学技術振興機構（JST）革新的GX技術創出事業GteX「バイオものづくり」領域の研究課題「GXを駆動する微生物・植物『相互作用育種』の基盤構築（研究代表者：野村暢彦、JPMJGX23B2）」、理研TRIPユースケースフィールドオミックスによる助成を受けて行われました。

原論文情報

• Shuhei Yabe, Yu Zheng, Shunji Takahashi, Chongyang Yang, Yui Nose, Shinichi Yamazaki, Nao Okuma, Mazytha Kinanti Rachmania, Fitria Ningsih, Wellyzar Sjamsuridzal, Mayuko Sato, Kiminori Toyooka, Yasunori Ichihashi, "Chromid-like secondary replicons as predicted key sites of biosynthetic gene clusters in Ktedonobacteria", mSystems, 10.1128/msystems.00197-26

発表者

理化学研究所
環境資源科学研究センター ホロビオント・レジリエンス研究チーム
研究員 矢部 修平（ヤベ・シュウヘイ）
チームディレクター 市橋 泰範（イチハシ・ヤスノリ）

報道担当

理化学研究所 広報部 報道担当
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