理化学研究所（理研）生命機能科学研究センター 発生エピジェネティクス研究チームの大字 亜沙 美研究員（研究当時、現 客員研究員）、平谷 伊智朗 チームディレクター、京都大学 医生物学研究所 幹細胞遺伝学分野の遊佐 宏介 教授らの共同研究チームは、細胞分裂後に染色体の秩序だった3次元構造が再構築されることが、その後のDNA複製[1]の開始に重要な役割を果たすことを明らかにしました。
本研究は、DNA複製の適切な制御には、DNA配列上の情報だけでなく、核内における染色体の3次元構造も重要であることを初めて実験的に示し、DNA複製制御の基本原理に新たな概念を提示するものです。
哺乳類のゲノムは、遺伝子の働きが活発な（転写が活性化している）Aコンパートメント[2]と、不活発でより凝縮したBコンパートメント[2]に区画化されており、これらは核内で空間的に分かれて存在しています。ゲノム上のAコンパートメントおよびBコンパートメント（A・Bコンパートメント）領域は、ゲノム上の各領域がいつ複製されるかを示す「複製タイミング[3]」の早い・遅い領域とよく対応しており、DNA複製はAコンパートメント領域から始まり、その後Bコンパートメント領域へと進みます。しかし、この対応関係がDNA複製制御にどのような役割を果たしているのかはよく分かっていませんでした。
今回、共同研究チームは、マウスES細胞[4]を用いて、複製タイミング異常を示す変異体を効率的かつ網羅的に選別できる独自の実験系を構築し、新たなDNA複製タイミング制御因子としてGINS4[5]タンパク質を同定しました。さらに、GINS4を特異的に枯渇させた細胞を解析したところ、GINS4が複製タイミングだけでなく、Bコンパートメント構造の形成にも関わることを見いだしました。また、核内コンパートメント構造が正しく形成されない細胞はDNA複製を開始できないことが分かり、核内コンパートメント構造の構築がDNA複製の制御を支える重要なプロセスであることを実験的に明らかにしました。
本研究は、科学雑誌『Nature Communications』オンライン版（8月10日付：日本時間8月10日）に掲載されました。
G1期からS期への移行時における核内A・Bコンパートメント形成と、DNA複製制御の関係
背景
生命の設計図であるゲノムDNAは、細胞分裂に先立って正確に複製される必要があります。哺乳類のように長大なゲノムを持つ生物では、DNA合成期（S期[1]）に染色体のさまざまな箇所から複製が始まります。しかし、ゲノム全体が一斉に複製されるのではなく、S期前半に複製される領域と、後半に複製される領域があらかじめ決まっており、この時間的制御は「複製タイミング制御」と呼ばれます。一方、染色体は細胞核内で空間的に区画化され、転写が盛んで遺伝子の働きが比較的活発なAコンパートメント領域と、転写が抑制されて染色体の構造もより凝縮したBコンパートメント領域に分かれています。一般に、Aコンパートメント領域は核内部に、Bコンパートメント領域は核膜周辺に存在し、それぞれS期前半、S期後半に複製される領域とよく対応しています。
このA・Bコンパートメントの構造は細胞分裂の際に一度失われますが、次のDNA複製が始まるまでに再構築されます。しかし、A・BコンパートメントがDNA複製の結果を反映したものにすぎないのか、それともDNA複製制御に重要な役割を果たしているのかを直接検証することは困難でした。A・Bコンパートメントはゲノム全体に及ぶ大規模な構造であり、これを簡単に操作する手法が存在しないからです。そこで共同研究チームは、DNA複製タイミングに異常を示す変異細胞を網羅的にスクリーニングし、その中でA・Bコンパートメントにも異常を示すものを見いだし、その原因遺伝子の機能解析を通じて、両者の関係とA・Bコンパートメントの生物学的意義を明らかにすることを目指しました。
研究手法と成果
共同研究チームはまず、DNA複製タイミングを1細胞レベルで検出できる独自のレポーター細胞を作製しました。これは、マウスES細胞の特定のゲノム領域に蛍光タンパク質の遺伝子を組み込むことで、その領域がS期前半と後半のどちらで複製されたかを蛍光強度の計測で推定できる仕組みです。この細胞を用いて全ゲノムスクリーニングを行い、DNA複製タイミング異常を示す変異細胞を網羅的に選別することで、DNA複製タイミング制御に関わる候補因子を効率的に探索しました（図1）。
図1 DNA複製タイミング異常を引き起こす原因遺伝子を同定する全ゲノムスクリーニング
- 左)複製タイミングを1細胞レベルで検出可能なレポーター細胞を用いた変異体プールの作製。S期前半に複製されるゲノム領域に蛍光タンパク質（GFP）の遺伝子を組み込むと、正常細胞ではS期が進むにつれてGFPの蛍光強度が高くなる。このレポーター細胞に、マウスのほぼ全ての遺伝子を網羅的に変異させる操作（gRNAライブラリー感染）を行い、変異体プールを作製した。
- 中)細胞の蛍光を1個ずつ測定・選別する装置を用いたフローサイトメトリーという手法で、GFP蛍光強度が低い（複製タイミングが遅い異常を示すことが期待される）細胞を分取（分離・精製）した。
- 右)次世代シーケンサーで変異遺伝子を同定し、個々の遺伝子が複製タイミングに影響している確からしさ（縦軸）を統計学的に解析した。複製タイミング異常の原因となった七つの候補遺伝子の中から、Gins4に着目した。
その結果、DNAヘリカーゼ[5]の構成因子であるGINS4を有力な候補因子として同定しました。GINS4は、DNA複製開始に必要な因子として知られています。そこで、GINS4の機能を詳しく調べるため、細胞内に存在するGINS4の分解を特異的に誘導できるマウスES細胞を作製しました。これによりGINS4を枯渇させた細胞（GINS4枯渇細胞）をHi-C法[6]で解析したところ、A・Bコンパートメント構造にも異常が生じることが分かりました。特に、Bコンパートメント領域同士の長距離相互作用が弱まり、AコンパートメントとBコンパートメントの分離が不十分になっていました（図2）。
図2 GINS4を特異的に分解・枯渇させた細胞のHi-C解析
- 上)Hi-C解析により、正常細胞およびGINS4を枯渇させたマウスES細胞における6番染色体の染色体相互作用頻度をヒートマップで示した。横軸と縦軸はいずれも、6番染色体30-120Mb（メガ・ベース：DNAの長さの単位で1Mbは100万塩基対）領域のDNA配列を並べたときの位置（ゲノム座標）を示し、色の濃い領域は相互作用頻度が高い（DNAが空間的に近い距離にある）ことを示す。青の破線で囲んだ領域はBコンパートメント間の相互作用頻度を示し、GINS4枯渇細胞ではこれが低下している。
- 下)A・B各コンパートメント同士の相互作用の強さをヒートマップで示した。GINS4枯渇細胞では、特にBコンパートメント間の相互作用強度がゲノムワイドに著しく低下している。
さらに、細胞周期[1]を同調させた細胞で、複製タイミングの早いAコンパートメント領域と遅いBコンパートメント領域にそれぞれ異なるラベルを入れて、両者を識別・可視化・追跡できる実験系を構築しました。この実験系を用いてさらに解析を進めたところ、通常は核膜周辺に位置するBコンパートメント領域のDNAが、GINS4枯渇細胞では核内で異常に大きな凝集体を形成することが分かり、Hi-Cデータが捉えていたBコンパートメントの3次元構造異常を顕微鏡下でも確認できました（図3A）。この異常は、GINS4のタンパク質量を回復させることで少なくとも目視レベルでは改善したため、GINS4の枯渇によって引き起こされるBコンパートメント構造の異常は可逆的であることが示唆されました。
図3 A・Bコンパートメント形成とゲノムDNA複製の密接な関係
- A)GINS4の枯渇はA・Bコンパートメントの分離異常を引き起こし、正常細胞では核膜周辺に位置するBコンパートメント領域のDNAが、核内部に凝集体を形成する。
- B)S期直前にGINS4を再蓄積させると、Bコンパートメント構造異常が回復した細胞から複製が開始される（複製DNAを示すラベルが増大する）。
- C)GINS4回復によるBコンパートメント構造の回復度に依存して、時間とともにDNA複製済み領域の割合が上昇する。ns：「not significant（有意差なし）」の略号。「**」は有意水準1％での有意差あり、「****」は有意水準0.01％での有意差あり、を示す。
そこで、このBコンパートメント構造異常の回復とDNA複製との関係を調べました。S期に入る前にタンパク質の分解誘導を解除して、GINS4の枯渇状態からGINS4を再蓄積させると、Bコンパートメントの異常な凝集体が消失し、DNA複製を開始する細胞が出現しました。一方、異常な凝集体が消失していない細胞では、S期になってもDNA複製は開始されませんでした（図3B、C）。これらの結果は、複製開始直前に秩序だったA・Bコンパートメントの構造が再構築されることが、DNA複製制御に重要な役割を果たすことを示しています。
さらに、GINS4の枯渇状態からGINS4を再蓄積させた細胞は、目視レベルではBコンパートメントの凝集体は消失したものの、Hi-C解析をするとA・Bコンパートメントの分離レベルが正常細胞よりも弱いことが分かりました。そこで、この状態でDNA複製を開始した細胞の複製タイミングを、1細胞全ゲノムDNA複製解析法（scRepli-seq[7]）で1細胞ずつ調べました。その結果、通常はS期後半に複製されるBコンパートメントの一部がS期前半から複製されるなど、複製タイミングが乱れていました（図4）。すなわち、ゲノム3次元構造を正常に構築していない細胞は、複製タイミング異常を示すことが分かりました。
図4 正常細胞とA・Bコンパートメント部分回復細胞のS期前期のscRepli-seqデータ比較
- 上)Hi-Cデータから算出したマウス1番染色体のA・Bコンパートメントの分布。Aコンパートメント（緑）はS期前半に、Bコンパートメント（赤）はS期後半に複製される。
- 中)S期前期の7個の正常細胞について、1細胞全ゲノムDNA複製解析法（scRepli-seq）による解析を行い、ゲノム複製率が低いものから高いものまで上から順に並べたもの。Aコンパートメント領域（上図の緑）に複製後の領域（青）が出現していることが分かる。
- 下)GINS4の枯渇後に再蓄積させたA・Bコンパートメント部分回復細胞のうち、S期前期の細胞8個のscRepli-seqデータ。これらの細胞ではA・Bコンパートメントの分離が完全には回復していないものの、DNA複製は開始される。しかし、複製タイミングは乱れており、本来この時期に複製されないBコンパートメント領域（上図の赤）からもDNA複製が始まっている。
今後の期待
本研究は、DNA複製開始直前、すなわちS期に入る直前に秩序だった染色体3次元構造を構築することが、その後のDNA複製を正しく進めるための重要な基盤となることを示しました。これまで、A・Bコンパートメントと複製タイミングの対応関係は知られていましたが、その因果関係を実験的に検証することは困難でした。GINS4を足がかりとしてコンパートメント構造を操作できるようになったことで、ゲノム3次元構造とDNA複製の因果関係に迫ることが可能になりました。本研究は、DNA複製制御がDNA配列情報だけでなくゲノム3次元構造にも支えられているという新たな概念を提示するものです。
GINS4がどのような分子機構によって、S期直前にBコンパートメントの形成や成熟を制御しているのかは、今後解明すべき重要な課題です。そのためには、GINS4が細胞核内やゲノム上のどこに局在し、どのような因子と協調して働くのかを明らかにする必要があると考えています。
DNA複製異常や複製タイミング異常は、ゲノム不安定性[8]や細胞のがん化と深く関わることが知られています。今回の成果は、細胞周期進行に伴うゲノム3次元構造制御とDNA複製制御を結び付ける新たな基礎的知見であり、将来的にゲノム不安定性やがんなどの疾患発症機構の理解にもつながると期待されます。
補足説明
- 1.DNA複製、S期、細胞周期
増殖中の真核細胞が繰り返す時間的なサイクル（期間）のことを細胞周期と呼ぶ。細胞周期の中で、分裂期（M期）は細胞分裂を行う期間、間期は分裂期以外の期間を指す。間期は、さらにG1期、S期、G2期に分けられる。DNA複製は、細胞分裂に先立って、細胞が持つゲノムDNAを過不足なく倍加する過程であり、S期に行われる。 - 2.Aコンパートメント、Bコンパートメント
ともに、Hi-C法（[6]参照）により検出される核内の大規模な染色体区画のこと。Aコンパートメントは比較的遺伝子転写活性の高いユークロマチン、Bコンパートメントは活性の低いヘテロクロマチンに対応する。 - 3.複製タイミング
ゲノムDNA上の各領域がS期のどの時期に複製されるかという時間的制御。一般に、遺伝子が活発に転写されるユークロマチン領域はS期前半に、凝縮したヘテロクロマチン領域はS期後半に複製される。 - 4.ES細胞
哺乳類の発生初期の胚盤胞期と呼ばれる時期の胚の一部、内部細胞塊と呼ばれる細胞群からつくられる幹細胞株のこと。胚性幹細胞とも呼ばれる。ESはembryonic stemの略。 - 5.GINS4、DNAヘリカーゼ
GINS4は、GINS1、GINS2、GINS3とともにGINS複合体を構成するタンパク質の一つ。GINS複合体は、DNAヘリカーゼ（DNA二重らせんをほどく酵素）であるCMG複合体（CDC45、MCM、GINSからなる）の構成要素であり、CMG複合体はDNA複製開始に必須の因子として知られている。 - 6.Hi-C法
核内でゲノムDNAのどの領域同士が近接しているかを、次世代シーケンサーを用いて全ゲノム規模で網羅的に測定する方法。A・Bコンパートメントをはじめとする、さまざまなスケールのゲノム3次元構造を同定・解析できる。 - 7.scRepli-seq
1細胞レベルでDNA複製の進行状態を全ゲノム解析する方法。1細胞から得たゲノムDNAを増幅し、複製済み領域と未複製領域をDNAコピー数の違いから推定する。 - 8.ゲノム不安定性
DNA配列の変化や、染色体の構造変化、染色体数の異常などが生じやすい状態。
共同研究チーム
理化学研究所 生命機能科学研究センター 発生エピジェネティクス研究チーム
チームディレクター 平谷 伊智朗（ヒラタニ・イチロウ）
研究員（研究当時）大字 亜沙美（オオジ・アサミ）
（現 客員研究員）
テクニカルスタッフⅠ 野田 和（ノダ・イヅミ）
テクニカルスタッフⅠ 一ノ瀨 孝子（イチノセ・タカコ）
研究パートタイマーⅡ 近藤 淑子（コンドウ・ヨシコ）
京都大学 医生物学研究所 幹細胞遺伝学分野
教授 遊佐 宏介（ユサ・コウスケ）
研究支援
本研究は、理化学研究所運営費交付金、理研新領域開拓課題「TADからゲノム構築原理を読み解く」、科学技術振興機構（JST）戦略的創造研究推進事業CREST「潜在的不安定性から読み解くゲノム設計原理（研究代表者：平谷伊智朗、JPMJCR20S5）」、文部科学省科学研究費助成事業新学術領域研究（研究領域提案型）「細胞分化にともなうクロマチンポテンシャルの変化とその分子基盤（研究分担者：平谷伊智朗、JP18H05530）」、日本学術振興会（JSPS）科学研究費助成事業挑戦的研究（開拓）「1細胞全ゲノム解析の第二世代化と多次元化への挑戦（研究代表者：平谷伊智朗、JP20K20582）」、同基盤研究（A）「マウス初期胚発生における体細胞型複製タイミング制御確立過程の解析（研究代表者：平谷伊智朗、JP25H00982）」、同若手研究「DNA複製可視化システムを利用した3Dゲノム制御因子の網羅的探索とその機能解析（研究代表者：大字亜沙美、JP18K14680）」、同基盤研究（C）「核内コンパートメントの構築原理と、ゲノム機能における役割の解明（研究代表者：大字亜沙美、JP25K09599）」、理研基礎科学特別研究員制度、理研CDB/BDR-大塚製薬連携センター研究助成、武田科学振興財団、京都大学医生物学研究所共同利用・共同研究拠点事業の支援を受けて行われました。
原論文情報
- Asami Oji, Kosuke Yusa, Izumi Noda, Takako Ichinose, Yoshiko Kondo, and Ichiro Hiratani, "Nuclear compartmentalization at the G1/S transition plays a key role in DNA replication control", Nature Communications, 10.1038/s41467-026-75264-6
発表者
理化学研究所
生命機能科学研究センター 発生エピジェネティクス研究チーム
チームディレクター 平谷 伊智朗（ヒラタニ・イチロウ）
研究員（研究当時）大字 亜沙美（オオジ・アサミ）
（現 客員研究員）
京都大学 医生物学研究所 幹細胞遺伝学分野
教授 遊佐 宏介（ユサ・コウスケ）
大字 亜沙美
平谷 伊智朗
遊佐 宏介
発表者のコメント
本プロジェクトの発案から9年が経ち、多くの方々に支えられながら、ようやく本論文をまとめることができました。GINS4を枯渇させた細胞を解析し、これまで見たことのない顕著なBコンパートメント構造の異常を見つけた時の驚きと感動は今も鮮明に覚えています。本研究を通して、新たに知りたい謎も数多く生まれたので、今後も常識にとらわれない視点を大切にしながら、サイエンスを続けていきたいです。（大字 亜沙美）
ゲノム3次元構造やA・Bコンパートメントの構築プロセスやその役割は、いまだに謎だらけです。ただ、A・Bコンパートメントは複製タイミングと強く相関するので、複製タイミングの制御因子を同定できれば、A・Bコンパートメントの構築原理や意義に迫れるのではないか。そんな素朴な発想からスタートした野心的なプロジェクトでした。満を持して投稿した論文でしたが、査読には実に3年近くを要し、納得することが難しい局面もあり、私のキャリアの中で最も苦しい査読対応でした。しかし、最後まで諦めずに取り組んだことで、オリジナルで質実剛健な研究成果を世に出せたと思います。筆頭著者の大字亜沙美さんのセンスと超人的な努力がなければ、到底成し遂げることのできなかった成果で、「サイエンスは人である」と改めて強く実感した次第です。（平谷 伊智朗）
これまで様々なタイプのCRISPRスクリーニングに関わってきましたが、今思い返してみても、最も複雑なスクリーニングだったと思います。GFP蛍光強度の変化が2倍以内というレポーター系を使い遺伝子破壊に伴う変化を検出すること、対象が複製という一過的な生命現象であることから、CRISPRスクリーニングがそもそも適用できるのか自信はありませんでした。しかし、筆頭著者の大字さんの丁寧な実験により、ヒット遺伝子が見出せたことは言うまでもありません。GINS4に着目してからの解析結果も毎回驚きの連続で、非常に緻密に計画し実行されていました。このようなプロジェクトに関わることができ、大変光栄に思います。（遊佐 宏介）
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